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MATERIALES Y MÉTODOS

Como animal de experimentación hemos escogido a ratas hembras vírgenes tipo Wistar, con un peso entre 200 y 250 gramos. Todas las ratas empleadas han vivido en condiciones normales antes y después de la cirugía, en el animalario de la Universidad de Málaga, en igualdad de condiciones ambientales. Se usaron un total de 74 animales:

  • A) Ratas a las que se les realiza laparotomía media, abrasión mecánica del peritoneo parietal y cierre de la laparotomía (Grupo control A): 16 individuos;
  • B) Intervenidas por laparoscopia: 16 individuos;
  • C) Tratadas con heparina intraperitoneal: 16 individuos;
  • D) Tratadas con malla de celulosa oxidada regenerada embebida en heparina: 16 individuos;
  • E) Ratas empleadas en realizar el estudio histológico: 10 ratas.

Preparamos una solución con hidrato de cloral purísimo (Cl3CCHO) diluyendo 2.5 g en 50 mL de suero salino. En primer lugar realizamos una sedación profunda del animal, con éter dietílico (C2H5-O-C2H). Una vez sedada la rata, le inyectamos 1.0 mL de la preparación de hidrato de cloral, por cada 300 mg de peso. Con la mayor asepsia posible, se realizó incisión media longitudinal, de unos 4.0 cm de longitud. Se realizó a continuación una abrasión mecánica del peritoneo parietal a ambos lados de la línea media y en una superficie aproximada de 1.0 cm. Para realizar la lesión del peritoneo, empleamos una pequeña bolita de estropajo doméstico, previamente esterilizado. En el grupo tratado con heparina, se administró una solución de 30 mL de suero fisiológico con 300 UI de Bemiparina® (Laboratorios Rovi, Madrid). En el grupo intervenido por vía laparoscópica, introdujimos una aguja de Verres en la línea media, creando neumoperitoneo con CO2, hasta conseguir una presión intraabdominal de 6.0 mm Hg. Insertamos un trócar de 5.0 mm también en la línea media por el que introdujimos una óptica de 0º de 5.0 mm y otro trócar del mismo calibre (5.0 mm) en el flanco izquierdo.

Para realizar la abrasión del peritoneo parietal de ambos hipocondrios, empleamos de nuevo la bolita de estropajo en el extremo de una pinza de laparoscopia. Para el grupo tratado con la malla saturada con heparina (D), previamente al tiempo quirúrgico, recortamos unas superficies de 1.2 cm_ de malla de celulosa oxidada regenerada estéril (Interceed® Laboratorios Johnson & Johnson, EEUU), en condiciones de asepsia. A cada cuadrado se le aplicó una gota de 13 _L de solución comercial de heparina lo que corresponde a 150 UI. Se dejaron secar al aire, bajo una campana estéril de flujo laminar de aire. Una vez secas se guardaron a 4.0º C en placas de Petri herméticamente cerradas.

Se intervinieron las ratas de la misma forma que los otros grupos, y se colocó una malla sin fijar, en cada zona lesionada de peritoneo, previo al cierre. Los animales fueron sacrificados en el tiempo 0 h (control), a las 24, 48 y 72 horas de la intervención, empleando una guillotina (cada grupo se subdividió en otros 4 de 4 ratas cada uno). Una vez sacrificado, cada animal fue relaparotomizado en condiciones de máxima asepsia. Descubierta la cavidad abdominal se recortó una superficie cuadrada de 10 x 10 mm de cada zona de peritoneo lesionado. Cada pequeña superficie peritoneal fue congelada inmediatamente en nitrógeno líquido y conservada a –80ºC hasta el momento de la determinación bioquímica.

En el momento de la medición, cada tubo fue descongelado a temperatura ambiente y cada extracto de peritoneo, lavado en un tubo de Eppendorf en un medio de 0.5 mL de solución compuesta por 0.15 M de NaCl y 5.0 mM de fosfato sódico dihidrogenado. Una vez lavadas, cada fragmento de peritoneo es colocado en otro Eppendorf con 1.0 mL de otra solución compuesta por 0.075 M de NaCl, 2.5 mM de fosfato sódico dihidrogenado y 0.25% (v/v) de detergente Tritón X-100. En esta solución fueron triturados los extractos por fricción en un Potter mecánico durante 60 segundos, a intervalos de 20. Se extrajo el contenido de cada tubo y se centrifugó a 12.000 x g durante 20 minutos a 4º C en una centrífuga HERAUS® Biofuge 13. Para asegurarnos que en la medición final las diferencias de absorbancia no se debían a la opacidad de la muestra, realizamos una nueva centrifugación, esta vez a 86.000 x g durante 20 minutos y a 4º C.

Estudio bioquímico
El método escogido para medir la actividad fibrinolítica del peritoneo, ha sido colorimétrico y cuantitativo tanto para determinar tPA como su inhibidor PAI-1. La cuantificación de tPA/PAI-1 de forma individual y no de la resultante de ambos sistemas enzimáticos (actividad del activador del plasminógeno o PAA), nos permite observar cómo se modifican individualmente a lo largo del tiempo postoperatorio. Empleamos un método para determinar tPA suministrado en kits, denominado COASET®tPA por los laboratorios Chromogenix® (Barcelona, España). La plasmina una vez activada interactúa con un sustrato cromogénico (S-2251) de lo que resultan péptidos y p-nitroanilina (pNA). Esta última es un colorante que tiñe la solución de amarillo. Es esa coloración amarilla la cuantificada con el espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Correlacionando las absorbancias obtenidas frente a los valores teóricos de la curva de calibración, encontramos una recta de regresión. Se ha realizado una recta previa a cada determinación: 1) Absorbancia = 0.05247 (mL/UI tPA) X + 0.00570; 2) Absorbancia = 0.08507 (mL/UI tPA) X + (-0.05728).

Para la medición del inhibidor del tPA (PAI-1), empleamos también un Kit específico denominado COATEST® PAI (Chromogenix®. Barcelona, España). Es una técnica específica para la determinación de la actividad del inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1). Este método se basa en añadir tPA en exceso al plasma. La plasmina reacciona con los sustratos cromogénico (S-2403) produciendo péptidos y p-nitroanilina (pNA) que tiñe la solución. Se procedió a elaborar la curva patrón o curva de calibración para el PAI-1: 1) Absorbancia = -0.02193 (mL/AU PAI) X + 0.995400; 2) Absorbancia = -0.032109 (mL/AU PAI) X + 1.805999.

Estudio macroscópico
Tratamos de describir los hallazgos macroscópicos que hemos encontrado en el momento de sacrificar los animales. Hemos creado una escala de gradación para la clasificación y mejor valoración de los resultados obtenidos:

0 = No valorable por fallecimiento del animal u otras causas
1 = Ninguna
2 = Escasas (adherencias laxas, que se separan fácilmente, con una suave tracción, adherencias del meso a la laparotomía, sin interesar ningún asa de intestino, ningún órgano adherido)
3 = Moderadas (adherencias vascularizadas que se separan con mayor tracción, algún asa implicada en la adherencia, uno o dos órganos adheridos)
4 = Severas (adherencias vascularizadas y firmes, sólo separables con tijeras, dos o más asas intestinales interesadas, más de dos órganos adheridos).

Estudio histológico
El estudio histológico complementa el estudio bioquímico y macroscópico de las adherencias, ya que permite identificar a nivel microscópico, las superficies implicadas en la formación de adherencias y su evolución en el tiempo. Se ha empleado la tinción de hematoxilina-eosina y la de tricrómico de Masson-Goldne, con objeto de estudiar la lesión peritoneal, la histología de la adherencia y poner de manifiesto las fibras.

Estadística
El análisis estadístico ha sido realizado con la ayuda del programa de ordenador SPSS 9.0. Hemos utilizado el test “t de Student” para muestras independientes para comparar cada serie con el control y entre ellas. Para el análisis descriptivo macroscópico, se ha aplicado un análisis de clasificación múltiple o test “chi cuadrado”.




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