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MATERIALES Y MÉTODOS
Como animal de experimentación hemos escogido a ratas hembras
vírgenes tipo Wistar, con un peso entre 200 y 250 gramos.
Todas las ratas empleadas han vivido en condiciones normales antes
y después de la cirugía, en el animalario de la Universidad
de Málaga, en igualdad de condiciones ambientales. Se usaron
un total de 74 animales:
- A) Ratas a las que se les realiza laparotomía media,
abrasión mecánica del peritoneo parietal y cierre
de la laparotomía (Grupo control A): 16 individuos;
- B) Intervenidas por laparoscopia: 16 individuos;
- C) Tratadas con heparina intraperitoneal: 16 individuos;
- D) Tratadas con malla de celulosa oxidada regenerada embebida
en heparina: 16 individuos;
- E) Ratas empleadas en realizar el estudio histológico:
10 ratas.
Preparamos una solución con hidrato de cloral
purísimo (Cl3CCHO) diluyendo
2.5 g en 50 mL de suero salino. En primer lugar realizamos una sedación
profunda del animal, con éter dietílico (C2H5-O-C2H).
Una vez sedada la rata, le inyectamos 1.0 mL de la preparación
de hidrato de cloral, por cada 300 mg de peso. Con la mayor asepsia
posible, se realizó incisión media longitudinal, de
unos 4.0 cm de longitud. Se realizó a continuación
una abrasión mecánica del peritoneo parietal a ambos
lados de la línea media y en una superficie aproximada de
1.0 cm. Para realizar la lesión del peritoneo, empleamos
una pequeña bolita de estropajo doméstico, previamente
esterilizado. En el grupo tratado con heparina, se administró
una solución de 30 mL de suero fisiológico con 300
UI de Bemiparina® (Laboratorios Rovi, Madrid). En el grupo intervenido
por vía laparoscópica, introdujimos una aguja de Verres
en la línea media, creando neumoperitoneo con CO2,
hasta conseguir una presión intraabdominal de 6.0 mm Hg.
Insertamos un trócar de 5.0 mm también en la línea
media por el que introdujimos una óptica de 0º de 5.0 mm
y otro trócar del mismo calibre (5.0 mm) en el flanco izquierdo.
Para realizar la abrasión del peritoneo parietal de ambos
hipocondrios, empleamos de nuevo la bolita de estropajo en el extremo
de una pinza de laparoscopia. Para el grupo tratado con la malla
saturada con heparina (D), previamente al tiempo quirúrgico,
recortamos unas superficies de 1.2 cm_ de malla de celulosa oxidada
regenerada estéril (Interceed® Laboratorios Johnson &
Johnson, EEUU), en condiciones de asepsia. A cada cuadrado se le
aplicó una gota de 13 _L de solución comercial de
heparina lo que corresponde a 150 UI. Se dejaron secar al aire,
bajo una campana estéril de flujo laminar de aire. Una vez
secas se guardaron a 4.0º C en placas de Petri herméticamente
cerradas.
Se intervinieron las ratas de la misma forma que los otros grupos,
y se colocó una malla sin fijar, en cada zona lesionada de
peritoneo, previo al cierre. Los animales fueron sacrificados en
el tiempo 0 h (control), a las 24, 48 y 72 horas de la intervención,
empleando una guillotina (cada grupo se subdividió en otros
4 de 4 ratas cada uno). Una vez sacrificado, cada animal fue relaparotomizado
en condiciones de máxima asepsia. Descubierta la cavidad
abdominal se recortó una superficie cuadrada de 10 x 10 mm
de cada zona de peritoneo lesionado. Cada pequeña superficie
peritoneal fue congelada inmediatamente en nitrógeno líquido
y conservada a –80ºC hasta el momento de la determinación
bioquímica.
En el momento de la medición, cada tubo fue descongelado
a temperatura ambiente y cada extracto de peritoneo, lavado en un
tubo de Eppendorf en un medio de 0.5 mL de solución compuesta
por 0.15 M de NaCl y 5.0 mM de fosfato sódico dihidrogenado.
Una vez lavadas, cada fragmento de peritoneo es colocado en otro
Eppendorf con 1.0 mL de otra solución compuesta por 0.075
M de NaCl, 2.5 mM de fosfato sódico dihidrogenado y 0.25%
(v/v) de detergente Tritón X-100. En esta solución
fueron triturados los extractos por fricción en un Potter
mecánico durante 60 segundos, a intervalos de 20. Se extrajo
el contenido de cada tubo y se centrifugó a 12.000 x g durante
20 minutos a 4º C en una centrífuga HERAUS® Biofuge 13.
Para asegurarnos que en la medición final las diferencias
de absorbancia no se debían a la opacidad de la muestra,
realizamos una nueva centrifugación, esta vez a 86.000 x
g durante 20 minutos y a 4º C.
Estudio bioquímico
El método escogido para medir la actividad fibrinolítica
del peritoneo, ha sido colorimétrico y cuantitativo tanto
para determinar tPA como su inhibidor PAI-1. La cuantificación
de tPA/PAI-1 de forma individual y no de la resultante de ambos
sistemas enzimáticos (actividad del activador del plasminógeno
o PAA), nos permite observar cómo se modifican individualmente
a lo largo del tiempo postoperatorio. Empleamos un método
para determinar tPA suministrado en kits, denominado COASET®tPA
por los laboratorios Chromogenix® (Barcelona, España).
La plasmina una vez activada interactúa con un sustrato cromogénico
(S-2251) de lo que resultan péptidos y p-nitroanilina (pNA).
Esta última es un colorante que tiñe la solución
de amarillo. Es esa coloración amarilla la cuantificada con
el espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Correlacionando
las absorbancias obtenidas frente a los valores teóricos
de la curva de calibración, encontramos una recta de regresión.
Se ha realizado una recta previa a cada determinación: 1)
Absorbancia = 0.05247 (mL/UI tPA) X + 0.00570; 2) Absorbancia =
0.08507 (mL/UI tPA) X + (-0.05728).
Para la medición del inhibidor del tPA (PAI-1), empleamos
también un Kit específico denominado COATEST®
PAI (Chromogenix®. Barcelona, España). Es una técnica
específica para la determinación de la actividad del
inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1). Este método
se basa en añadir tPA en exceso al plasma. La plasmina reacciona
con los sustratos cromogénico (S-2403) produciendo péptidos
y p-nitroanilina (pNA) que tiñe la solución. Se procedió
a elaborar la curva patrón o curva de calibración
para el PAI-1: 1) Absorbancia = -0.02193 (mL/AU PAI) X + 0.995400;
2) Absorbancia = -0.032109 (mL/AU PAI) X + 1.805999.
Estudio macroscópico
Tratamos de describir los hallazgos macroscópicos que hemos
encontrado en el momento de sacrificar los animales. Hemos creado
una escala de gradación para la clasificación y mejor
valoración de los resultados obtenidos:
0 = No valorable por fallecimiento del animal u otras causas
1 = Ninguna
2 = Escasas (adherencias laxas, que se separan fácilmente,
con una suave tracción, adherencias del meso a la laparotomía,
sin interesar ningún asa de intestino, ningún órgano
adherido)
3 = Moderadas (adherencias vascularizadas que se separan con mayor
tracción, algún asa implicada en la adherencia, uno
o dos órganos adheridos)
4 = Severas (adherencias vascularizadas y firmes, sólo separables
con tijeras, dos o más asas intestinales interesadas, más
de dos órganos adheridos).
Estudio histológico
El estudio histológico complementa el estudio bioquímico
y macroscópico de las adherencias, ya que permite identificar
a nivel microscópico, las superficies implicadas en la formación
de adherencias y su evolución en el tiempo. Se ha empleado
la tinción de hematoxilina-eosina y la de tricrómico
de Masson-Goldne, con objeto de estudiar la lesión peritoneal,
la histología de la adherencia y poner de manifiesto las
fibras.
Estadística
El análisis estadístico ha sido realizado con la ayuda
del programa de ordenador SPSS 9.0. Hemos utilizado el test “t
de Student” para muestras independientes para comparar cada
serie con el control y entre ellas. Para el análisis descriptivo
macroscópico, se ha aplicado un análisis de clasificación
múltiple o test “chi cuadrado”.
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